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本文作者：楊青青1,2李曉云2陳健2彭翼飛2馬文麗2鄭文嶺1,2作者單位：1上海大學(xué)生命科學(xué)院2南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所

stat6-ORF和STAT6-RNAi載體構(gòu)建成功

應(yīng)用高保真酶和自行設(shè)計的引物進行PCR擴增，結(jié)果顯示成功擴增了STAT6基因ORF的全長片段2544bp；測序結(jié)果表明擴增的STAT6-ORF沒有發(fā)生突變（因序列過長，本文未予列出）。將STAT6-ORF片段連接至pLVTHm載體后，通過ClaⅠ和MulⅠ雙酶切，獲得大小與STAT6-ORF相符的片段（約2500bp片段）（圖1A）；測序結(jié)果也顯示插入序列無堿基突變，表明成功構(gòu)建過表達載體pLVTHm-STAT6-ORF。采用化學(xué)合成方法合成STAT6-RNAi片段，將其連接至pLVTHm載體后，挑取陽性克隆進行酶切和測序鑒定。測序結(jié)果顯示，插入片段無突變（圖1B），表明成功構(gòu)建抑制表達載體pLVTHm-STAT6-RNAi。

STAT6-ORF和STAT6-RNAi載體的慢病毒包裝及報告子的驗證

分別將pLVTHm空表達載體、pLVTHm-STAT6-ORF過表達載體或pLVTHm-STAT6-RNAi抑制表達載體與輔助質(zhì)粒psPAX2和PMD2.G共轉(zhuǎn)染到293FT細胞中進行慢病毒包裝。熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，3個載體的感染效率均在80%以上（圖2）。收集病毒上清液進行病毒顆粒濃縮，pLVTHm空病毒組、STAT6-ORF轉(zhuǎn)染組和STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染組慢病毒顆粒的病毒效價分別為3.0×107、2.7×107和4.1×107pfu/mL，證實這3個載體均可用于感染RKO細胞。

病毒感染RKO細胞后STAT6表達的變化

通過50μg/mLTET篩選及25μg/mLTET維持培養(yǎng)，獲得了感染STAT6-ORF或STAT6-RNAi慢病毒的RKO穩(wěn)定細胞株。RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明，感染pLVTHm-STAT6-ORF或pLVTHm-STAT6-RNAi慢病毒載體的RKO細胞中STAT6mRNA和蛋白的表達水平較對照組明顯升高或降低。由此說明，本研究成功獲得了STAT6過表達和抑制表達的RKO細胞（圖3）。

STAT6過表達及抑制表達對RKO細胞增殖的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)組成型表達STAT6-ORF的RKO細胞增殖變化不明顯，但從第2代開始，細胞增殖速度提高；轉(zhuǎn)染了pLVTHm-STAT6-RNAi的細胞增殖減緩，隨著培養(yǎng)時間的延長及細胞的傳代（待RKO細胞傳至第3代時，絕大多數(shù)細胞已死亡），細胞逐漸崩解，發(fā)生漂浮死亡（圖4A）。CCK8法檢測結(jié)果顯示，與感染第1代（病毒感染細胞0h）的細胞活性相比，過表達STAT6-ORF的RKO細胞的活性增強并不明顯（F＝0.650，P＝0.609）；而轉(zhuǎn)染STAT6-RNAi的RKO細胞的活性從第2代開始下降，其第3代和第4代細胞的活性均顯著低于第1代（F＝290.114，P＜0.001）（圖4B）。

STAT6過表達及抑制表達對RKO細胞遷移的影響

Transwell小室實驗結(jié)果（圖5）表明，正常培養(yǎng)的RKO細胞具備遷移能力；當(dāng)過表達STAT6-ORF后，細胞遷移能力提高，尤其是轉(zhuǎn)染后48h時差異顯著（F＝573.568，P＜0.01）；而轉(zhuǎn)染STAT6-RNAi后，細胞遷移能力顯著下降（F＝103.274，P＜0.01）。

Jak-STAT信號通路是細胞內(nèi)除Ras-MAPK之外另一條重要的腫瘤相關(guān)信號通路[5]，迄今為止已發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵分子STAT家族中的7個成員，包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6[6]。轉(zhuǎn)錄因子STAT6可被IL-4和IL-13所激活，IL-4/IL-13介導(dǎo)重疊的生物功能，其膜受體有2種，一種是IL-4Rα，另一種是IL-13Rα1，后者為低親和結(jié)合受體[7-9]。在免疫細胞中，STAT6是IL-4介導(dǎo)輔助性T細胞2（helperTcell2，Th2）分化所必需的上游轉(zhuǎn)錄因子。IL-4可激活STAT6的表達，STAT6在細胞質(zhì)中通過磷酸化激活后轉(zhuǎn)位至細胞核，結(jié)合特異啟動子元件DNA位點（5’-TTCN4GAA-3’），繼而啟動下游基因的表達[10-12]。STAT6啟動的下游基因包括細胞膜表達分子CD23、MHCclassⅡ和IL-4Rα等[3,13]。同時，激活的STAT6還可下調(diào)炎性反應(yīng)因子IL-12和TNF-α等的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，STAT6基因敲除的Th2細胞與IL-4Rα缺失的Th2細胞具有相似的表型，即缺乏分化的Th2細胞[14,15]。在腫瘤細胞中，激活的STAT6具有抗腫瘤作用，如原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌荷瘤小鼠缺失STAT6可導(dǎo)致腫瘤細胞逃離免疫監(jiān)督[14,15]。然而，進一步的研究發(fā)現(xiàn)STAT6在多種腫瘤細胞中表達異常，包括前列腺瘤[16]、T細胞淋巴瘤[17]、霍奇金淋巴瘤[18]、結(jié)直腸癌[19]和原發(fā)性縱隔腔大B細胞淋巴瘤[20]。Li等[21]發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌細胞株HT-29可自發(fā)性表達Th2細胞因子基因（例如：IL-4、IL-13、GATA-3、CDK4、CD44v6和S100A4），促進腫瘤細胞的分裂和轉(zhuǎn)移，并拮抗腫瘤細胞的凋亡；而在人結(jié)腸腺癌細胞株Caco-2中，IL-4/STAT6信號通路失活，即IL-4不能激活STAT6，腫瘤細胞傾向于自發(fā)性表達Th1和Th17細胞因子基因（例如：IFNγ、TNFα、IL-12A、IL-17、IL-23、T-bet、CDKN1A、CDKNIB、CDKN2A和NM23-H1），可影響細胞周期，抑制腫瘤細胞遷移，并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[21,22]。上述研究結(jié)果表明，IL-4/STAT6信號通路基因激活與否與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究構(gòu)建了帶有GFP標(biāo)志的STAT6-ORF/STAT6-RNAi表達載體，并將其包裝成慢病毒顆粒，感染人結(jié)腸癌RKO細胞株，結(jié)果表明成功構(gòu)建及包裝了STAT6-ORF和STAT6-RNAi的慢病毒表達載體，通過病毒顆粒感染RKO細胞并獲得了穩(wěn)定表達的細胞株。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT6-ORF轉(zhuǎn)染的RKO細胞的增殖速度加快并不明顯（P＝0.609），但細胞遷移能力卻明顯增強（P＜0.01）；STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染的RKO細胞活性顯著降低（P＜0.001），遷移能力也顯著減弱（P＜0.01）?？傊狙芯客ㄟ^STAT6基因過表達及抑制表達實驗，發(fā)現(xiàn)STAT6可能是促進結(jié)腸癌細胞增殖和遷移的重要轉(zhuǎn)錄因子。在此基礎(chǔ)上，本課題組將進一步探討STAT6促進結(jié)腸癌細胞增殖和遷移的分子機制。