前言：本站為你精心整理了青藤堿對佐劑性關節(jié)炎免疫功能影響范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

摘要：【目的】觀察青藤堿（SINO）對佐劑性關節(jié)炎（AA）大鼠炎癥免疫功能的影響?！痉椒ā窟x用SD大鼠隨機分為正常組，模型組，SINO低、中、高劑量組（劑量分別為60、120、240mg/kg），雷公藤多苷（TPT）組（劑量為30mg/kg）；除正常組外，其他組均采用弗氏完全佐劑足跖皮內注射復制AA模型；各組于造模后第12天開始給藥，連續(xù)12d；觀察不同時間段的大鼠足趾腫脹度及關節(jié)評分；采用放射免疫法檢測滑膜細胞白細胞介素1β（IL1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）的含量；觀察各組大鼠滑膜細胞的超微結構；采用逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測各組滑膜細胞IL1βmRNA、TNFαmRNA的表達?！窘Y果】各劑量組SINO均可不同程度降低大鼠足趾腫脹度和關節(jié)炎評分，抑制滑膜細胞產生IL1β、TNFα，降低滑膜細胞IL1βmRNA、TNFαmRNA的表達（P＜0.05或P＜0.01），恢復AA大鼠滑膜細胞的形態(tài)。【結論】SINO治療類風濕性關節(jié)炎的作用可能與其能抑制滑膜細胞分泌炎性介質，恢復滑膜細胞形態(tài)有關。

關鍵詞：青藤堿/藥理學；關節(jié)炎，類風濕/中藥療法；關節(jié)炎，類風濕/免疫學；滑膜細胞/超微結構；

疾病模型，動物；大鼠

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎為關節(jié)滑膜炎，病因不明，臨床表現(xiàn)復雜多樣，嚴重危害了人類的身體健康。青藤堿（sinomenine，SINO）是從中藥青風藤中提取的生物堿單體，具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等藥理作用［1-2］。本研究以佐劑性關節(jié)炎（AA）大鼠為模型，觀察SINO對AA大鼠滑膜細胞超微結構及分泌炎性細胞因子的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1動物SD大鼠,普通級,體質量180～200g，雄性，由安徽省醫(yī)學研究所實驗動物中心提供，合格證號：皖醫(yī)動準01號。

1.2藥物及試劑青藤堿（湖南正清制藥廠生產，批號：0009101）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司提供，批號：031020）；RPMI1640粉（Sigma公司提供）；雷公藤多苷片（TPT，上海復旦復華藥業(yè)有限公司生產，批號：060503）；卡介苗（BCG，衛(wèi)生部上海生物制品研究所產品，批號：20060101）；RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司產品）；125IIL1β放免試劑盒購于北京北方生物研究所，其他試劑為分析純。IL1β引物大小377bp，上游：5′TTGTGGCTGTGGACAAGCTG3′，下游：5′GCCGTCTTTCATACACAGGG3；TNFαmRNA引物大小249bp；上游：5′CTGGGCAGCGTTTATTCT3，下游：5′TTGCTTCTTCCCTGTTCC3；內參照βactin引物大小147bp，上游：5′CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC3′，下游：5′CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG3′；以上引物均由上海生工公司合成。

1.3儀器JT12001型電子天平由上海精天電子儀器廠生產；YLSTA足趾容積測量儀由山東省醫(yī)學科學院設備站生產；水套式CO2培養(yǎng)箱為美國SHELLAB產品；GL20A全自動高速冷凍離心機由湖南儀器儀表總廠離心機廠生產；YJ1450型醫(yī)學凈化工作臺由蘇州凈化設備公司生產；倒置式顯微鏡為日本Olympus產品；J1230型透射電鏡為日本電子公司產品；GC911型α放射免疫計數(shù)儀由中國科學技術大學中佳公司生產。

1.4分組、給藥及造模SD大鼠隨機均分為6組：正常組，模型組，SINO低、中、高劑量組（60、120、240mg/kg）和TPT組（30mg/kg），每組10只。按文獻報道造模［3］，除正常組外，其他各組均以弗氏完全佐劑（卡介苗80℃、1h水浴滅活后與高壓滅菌的液體石蠟充分碾磨混勻配成10mg/mL的乳劑）于每鼠左后足趾皮內注射0.1mL致炎。各給藥組分別于致炎第12天開始灌胃給藥，連續(xù)12d，正常組及模型組給予等容積的溶媒。

1.5AA大鼠評價參照文獻［3］，采用足趾容積儀排水法測定右踝關節(jié)以下的容積（mL），分別于用藥前、用藥后第4、8、12、16天同法測量非致炎足的容積變化，以致炎前后差值表示其腫脹度（V腫脹）。多發(fā)性關節(jié)炎評分如下，0分：無腫脹；1分：1個趾關節(jié)受累；2分：多趾關節(jié)受累；3分：踝關節(jié)以下受累；4分：全爪受累。

1.6滑膜細胞培養(yǎng)致炎后第28天大鼠清醒狀態(tài)下股動脈放血處死。無菌取雙側膝關節(jié)滑膜組織，滑膜細胞培養(yǎng)按文獻［4-5］方法進行。以RPMI1640重懸細胞1×109個/L，取500μL細胞懸液和10mg/L脂多糖（LPS）500μL置6孔板中，37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h，收集上清液，-20℃儲存，按125I放免試劑盒說明書方法進行白細胞介素1β（IL1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）含量測定。

1.7透射電鏡檢查收集滑膜細胞以體積分數(shù)4%戊二醛Millonings緩沖液預固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，10g/L鋨酸固定2h，梯度乙醇逐級脫水；環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察攝像。

1.8滑膜組織IL1βmRNA、TNFαmRNA的檢測滑膜組織IL1β、TNFα總RNA提取采用常規(guī)逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）［4］，用凝膠圖像分析儀掃描，LabImage3.2凝膠圖像分析軟件求出目的條帶灰度與內參照βactin標準條帶的比值（p）。

1.9統(tǒng)計學方法采用SPSS14.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1SINO對AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響表1結.2SINO對AA大鼠多發(fā)性關節(jié)炎影響表2結果顯示，致炎后第16天，模型組大鼠非致炎足關節(jié)開始出現(xiàn)紅腫、變形，行走不便。SINO各劑量組均可顯著抑制AA大鼠繼發(fā)性關節(jié)病變（P＜0.05或P＜0.01）。表1SINO對AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較表2SINO對AA大鼠多發(fā)性關節(jié)炎的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

2.3SINO對滑膜細胞超微結構的影響滑膜組織中有兩型滑膜細胞，A型滑膜細胞起源于巨噬細胞，B型滑膜細胞起源于成纖維細胞。正?；そM織以B型細胞為主，其特征是粗面內質網、游離核糖體較多；與正常組大鼠相比，AA大鼠則多見A型滑膜細胞，細胞內囊泡增多，A型細胞含明顯的高爾基體和囊泡分散于細胞質內，粗面內質網少，線粒體腫脹、嵴突破壞；B型滑膜細胞數(shù)量減少。各給藥組大鼠以B型滑膜細胞為主，B型滑膜細胞粗面內質網略有擴張，但數(shù)量減少，少數(shù)線粒體腫脹，以SINO中、高劑量組和TPT組改善作用更為明顯，結果見圖1。

2.4SINO對IL1β、TNFα含量的影響表3結果顯示，模型組IL1β、TNFα高表達，而SINO中、高劑量組對AA大鼠滑膜組織IL1β、TNFα的生成有顯著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5SINO對滑膜IL1β及TNFαmRNA表達的影響表4結果顯示，正常組IL1β及TNFαmRNA低表達，模型組高表達（P＜0.05），SINO各劑量組均可不同程度降低IL1β及TNFαmRNA高表達（與模型組比較，P＜0.05或P＜0.01），且呈一定的劑量效應關系。表3SINO對滑膜細胞產生IL1β、TNFα含量的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較表4SINO對IL1βmRNA、TNFαmRNA表達的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

3討論

在RA的病理過程中，滑膜炎的一個重要特征是不能控制的滑膜細胞增殖，這種基質成纖維樣細胞的增殖被認為是"腫瘤樣"的，具有較大的破壞性且重復出現(xiàn)，最終侵襲軟骨，造成軟骨和骨的破壞［5］?；そM織和關節(jié)腔內的A型滑膜細胞有吞噬異物的作用，占滑膜細胞總數(shù)的10%左右；B型滑膜細胞為主要的滑膜細胞，能合成和修飾所有的細胞外基質(ECM)和滑液成分，其分泌的透明質酸在潤滑關節(jié)、營養(yǎng)肌腱等方面發(fā)揮重要作用,具有較強的損傷修復能力［7］。通過對各組滑膜組織超微結構的觀察，發(fā)現(xiàn)SINO能顯著增加B型滑膜細胞的數(shù)量，同時降低A型滑膜細胞的數(shù)量，提示SINO在調節(jié)炎癥致滑膜細胞分化異常，促使炎癥修復方面起著一定的作用。

RA中的滑膜細胞、淋巴細胞、巨噬細胞處于高度活化狀態(tài)，可合成IL1β與TNFα等多種炎性細胞因子。釋放入關節(jié)滑膜液及血液中的細胞因子IL1β與TNFα有許多相似的生物學活性，如促進滑膜纖維細胞和軟骨細胞生成膠原酶和前列腺素，誘導糖蛋白的分解與骨的吸收，抑制糖蛋白的合成與骨的形成，刺激B型滑膜細胞增生，使滑膜增厚，生成大量基質金屬蛋白酶等［6］。從功能上分析，分布于A型滑膜細胞內的高爾基復合體參與分泌活動，線粒體則為細胞代謝提供能量；B型滑膜細胞內的粗面內質網具有分泌蛋白質等功能［8］。本研究通過對不同類型滑膜細胞具有分泌、代謝功能的細胞器進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)AA模型組在致炎后28d時，滑膜細胞的代謝活性及IL1、TNFα分泌功能均有所亢進；各治療組A、B型滑膜細胞中高爾基體、線粒體、粗面內質網、囊泡的數(shù)量均有所減少，表明SINO可降低亢進的滑膜細胞功能，保護滑膜細胞結構，從而減輕滑膜細胞變性。在本研究中，AA大鼠滑膜細胞釋放較高水平的IL1β、TNFα，SINO可抑制IL1β、TNFα的產生，下調致炎因子IL1mRNA、TNFαmRNA的表達。表明SINO可通過降低AA大鼠滑膜細胞活化而減輕繼發(fā)性炎癥，該抑制滑膜細胞分泌亢進的功能與透射電鏡觀察到滑膜細胞具分泌功能細胞器形態(tài)改變的結果一致。因此，SINO治療類風濕性關節(jié)炎的作用可能與其能抑制滑膜細胞分泌炎性介質，恢復滑膜細胞形態(tài)有關。

【參考文獻】

［1］王勇，方勇飛，周新，等.青藤堿對佐劑性關節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞表達細胞因子的影響［J］.中華風濕病學雜志,2003,7(7):415.

［2］陳光星，劉良，趙詩哲，等.青藤堿對膠原誘導型關節(jié)炎大鼠滑膜細胞增殖及凋亡影響的研究［J］.中華風濕病學雜志,2005,9(5):284.

［3］陳曉宇，李俊，解雪峰，等.野菊花總黃酮誘導佐劑性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞凋亡［J］.解剖學報,2007,38(5):569.

［4］NikiY，YamadaH，SekiS，etal.MacrophageandneutrophildominantarthritisinhumanIL1alphatransgenicmice［J］.JClinInvest，2001，107：1127.

［5］王斌,陳敏珠,徐叔云.大鼠滑膜細胞的分離和培養(yǎng)［J］.中國藥理學通報，1994，10（1）:73.

［6］李衛(wèi)東，冉國霞，林志彬，等.來氟米特對佐劑性關節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞IL1,IL6和TNFα產生的動態(tài)影響［J］.中國藥理學報，2002，23（8）:752.

［7］DeBariC,DelIAccioF,TylzanowskiP,eta1.Multipotentmesenchymalstemcellsfromadulthumansynovialmembrane［J］.ArthritisRheum，2001，44(8)：1928.

［8］LevickJR,McDonaldJN.Ultrastructureoftransportpathwaysinstressedsynoviumofthekneeinanaesthetizedrabbits［J］.JPhysiol，1989，419（2）：493.